鶴岡夏海
極低濃度メタンを酸化分解する土壌中メタン酸化細菌の培養と検出
山口隆司教授、幡本将史特任准教授
メタンは温室効果ガスであり、年々その大気中濃度は上昇し続けている。森林土壌は大気中メタンの効果的な吸収源であり、その吸収の役割はメタン酸化細菌が担っている。しかし、大気レベルのメタンを酸化できるメタン酸化細菌の分離株は少なく、知見が少ないのが現状である。そこで本研究では、大気中メタンの酸化に関する知見の収集及び、大気レベルのメタンを酸化分解するメタン酸化細菌の集積培養および検出を行った。
はじめに、環境土壌中におけるメタン酸化の調査のため、pH、含水率、メタン酸化活性の測定および、メタン酸化を触媒する酵素のαサブユニットをコードしたpmoA遺伝子（メタン酸化細菌が固有に持つ遺伝子）の検出を行った。その結果、5カ所全ての土壌が酸性を示し、それらほとんどの土壌が、活性値は異なるもののメタンの酸化が確認された。このうち、pmoA遺伝子が検出されたのは一カ所 (土壌A) のみであった。また、メタン酸化活性値が最も高かった土壌Bは、pmoA遺伝子が検出されなかったにも関わらず、約9 ppmのメタンを9時間後には大気濃度と同程度にまで濃度を低下させた。
集積培養には、これまでの調査でpmoA遺伝子が検出された土壌Aおよび、高いメタン酸化活性値を有していた土壌Bを植種源として用いた。これまでの研究において集積培養に用いられた基質としてのメタン濃度は0.02〜数%であったが、本研究ではより大気レベルに近い8.9 ppmのメタンを含む混合ガスを基質として用いた。
集積培養系内のメタン酸化活性試験を行った結果、用いた2種類の培養系 (土壌を直接カラムに入れた系：カラム1、 土壌をスポンジ担体に植種してカラムに入れた系：カラム2) は、メタン酸化活性値とその値のばらつきに違いが見られた。土壌A、Bどちらにおいても、カラム1はカラム2と比較すると活性値が安定していた培養系であった。集積培養系内のクローニング解析の結果、検出されたpmoA遺伝子は、全てがMethylocystis属に近縁な微生物であった。pmoA遺伝子に基づいた系統解析の結果、本研究で得られたクローンは、既報の大気レベルのメタンを酸化できるメタン酸化細菌とは別のクラスターに分類された。このことより、新たな大気レベルのメタンを酸化できるメタン酸化細菌である可能性が示された。
培養に用いた土壌の植生や、pHが異なるにも関わらず、同じMethylocystis属に近縁な微生物が検出されたことから、8.9 ppmでのメタン酸化を優占的に担うのはMethylocystis属であることが示唆された。 また、大気レベルのメタン酸化を担う他の微生物を集積するためには、メタン濃度や培地などの培養条件の更なる検討が必要だと考えられる。
Forest soil is important sink of atmospheric methane. In soil, methane oxidation bacteria (MOB) play the role of oxidation of atmospheric methane. In this study, I did the enrich culture of MOB in soil and detect. Methane concentration is 8.9 ppm for the culture. This concentration is lower than previous work. Samples were collected from 5 points in our university. 2 soils (Soil A and Soil B) were used for culture. Soil A is the only detect pmoA genes out of 5 samples. Soil B is the highest methane oxidation activity out of them. Culture condition is used 8.9 ppm methane in air as substrate, 5 ml/week of inorganic salt medium (adjust pH 5.5 for soil A, 6.0 for soil B) and under 30℃.
In the enrichment culture systems, methane oxidation activity was not stable. And there were no trend of increasing and decreasing with culture days. After culture, i took the soil from the systems and did the cloning. The result, all system detected the clone closely related to Methylocystis sp. Phylogenetic tree of the derived DNA sequence of pmoA gene show that the clones which collected my culture system are different from atmospheric methane oxidizer which were reported previous work. This study show that 8.9 ppm methane oxidizer is Methylocystis sp. in the system. In spite of different culture condition (vegetation, pH), dominant MOB is similar. So if you want to culture the culture MOB like USCα, USCγ and cluster1, you need think other cultivation condition like methane concentration, culture system and medium etc.
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