関谷努力

環境微生物の機能と系統分類を結び付けるための新規DNA回収技術の開発

井町寛之，大橋晶良，原田秀樹

我々人類が培養可能な微生物は自然界の1%以下に過ぎないといわれている．そのような現状のなか，環境中の微生物群集構造を培養に依らずに解析する手法として，クローン解析などの特定の遺伝子を分子マーカーとした解析手法が広く用いられている．これらの手法を用いることで，微生物群集の系統的な多様性や特定の遺伝子に基づく機能をもつ微生物の多様性を把握することが出来る．しかしながら，どの系統の微生物が解析を行った機能を有しているか，また，その機能を持つ微生物はどの系統に属しているのかを推定することは困難で，それぞれの解析結果を結び付けて理解できていないのが現状である．
そこで，我々は環境中から16S rRNA遺伝子と機能遺伝子を同一のDNA鎖上に含む様な長さを持つゲノムDNAを特異的に回収・解析することで，微生物の系統分類と機能を結びつけて理解するという新たな微生物解析方法論を提案した．この方法論を実現するためには，Mega base pair (Mb) レベルの長さであるゲノムDNAを極力切断せずに回収する手法の開発が必要である．本研究では，標的核酸に対する高い親和性と配列識別能を併せ持つ人工核酸PNAを応用し，新規DNA回収手法の開発を行った．
DNA回収手法を立ち上げるために，磁性ビーズを用いてモデル微生物のDNAの回収を行い，大まかなDNA回収プロトコールを構築することができた．次に，モデル微生物と非標的微生物のDNAを混合した２種混合系，モデル微生物と汚泥から抽出したDNAを混合した複合系でDNA回収条件の検討を行った．その結果，標的DNAの回収を確認することができたが，同時に若干の非特異的なDNA回収も確認された．この大きな原因として磁性ビーズによるDNAの巻き込み現象の発生が考えられた．種々の対策を講じたが，解決は困難であると判断し磁性ビーズを用いた手法の開発を断念した．
次に，DNAの巻き込みが発生しにくいと考えられる方法としてストレプトアビジン被膜チューブを用いたDNA回収手法の開発を行った．この系では，交雑温度とNaCl濃度について，DNA回収可能な条件範囲の決定を行い，その条件を元にプロトコールの検討を行った．その結果，標的DNAが5％以下の低存在率のサンプルからは，DNAを回収するまでには至らなかったが，標的DNAの存在率が10%以上であれば，Mbレベルの長さのDNAを配列特的に回収できることが強く示唆された．