阿部　勝正

アカガイアスパラギン酸ラセマーゼ遺伝子のクローニング

山田　良平、解良　芳夫、高橋　祥司


　かつて非天然化合物と考えられていたD-アミノ酸は、近年、哺乳類を含む動物界に普遍的に存在する事が明らかとなり、その生理機能に関する研究が精力的に進められている。しかしながら、その生合成経路に関してはいまだ未知な部分が多い。これまで当研究室では、高濃度のD-アスパラギン酸を含有するアカガイ Scapharca broughtoniiから、ピリドキサール 5'-リン酸（PLP）に依存的な酸性アミノ酸ラセマーゼとしては初めて、また真核生物由来としても初めて、アスパラギン酸ラセマーゼを精製し、その諸性質を解析してきた。その結果、本酵素はAMPにより活性化され、ATPにより阻害されるという、他のアミノ酸ラセマーゼには類を見ない特性を有している事が明らかとなり、本酵素は既知のアミノ酸ラセマーゼとは異なる構造を有していることが示唆された。しかしながら、その構造に関する知見は現在のところ乏しいままである。そこで本研究では、本酵素の構造と機能の関係を明らかにすることを目的とし、本酵素遺伝子のクローニングを検討した。

　アカガイの足先端から、硫酸ナトリウム分画、Blue Sepharoseカラム、AMP Sepharoseカラム、ゲル濾過Sephacryl S-100カラムクロマトグラフィー、SDS-PAGE、ゲルからの抽出という精製過程を経て、均一なアスパラギン酸ラセマーゼを得た。アカガイ足先端から精製した本酵素を特定のペプチド結合に特異的な酵素で加水分解し、得られたペプチドのアミノ酸配列を決定した。得られたアミノ酸配列から設計した縮重プライマーを用いて、PCRにより本酵素の部分遺伝子断片を取得した後、RACE法を用いて全長cDNA配列を明らかにした。本酵素遺伝子を大腸菌で発現させたところ、アスパラギン酸ラセマーゼ活性がその粗酵素抽出液に確認され、その比活性はアカガイの粗酵素抽出液の約130倍と非常に高い値を示した。