酵母Cryptococcus humicolus UJ1のアクチン遺伝子単離の検討

成田 俊介

山田 良平、解良芳夫、高橋祥司

アミノ酸はタンパク質の構成成分であり、生体内の代謝において重要な役割を持っている。アミノ酸にはD-体とL-体が存在しているが、そのうちD-アミノ酸は天然には存在せず、人工的に合成されたものであると考えられてきた。しかし近年、HPLCなどの微量分析機器の向上により、生体内にD-アミノ酸が存在していることが明らかになった。中でもD-アラニン、D-セリン、D-アスパラギン酸などが意外に多量に存在していることが明らかとなり、その生体内における機能についての研究が進行中である。本研究室では当研究室の氏家により見出された、酸性D-アミノ酸の酸化的脱アミノ反応を触媒する、D-アスパラギン酸オキシダーゼを多量に生産する酵母Cryptococcus humicolus UJ1の研究を行ってきた。UJ1はD-Aspを唯一の窒素源として生育させたときにのみD-アスパラギン酸酸化酵素を多量に生産し、D,L-グルタミン酸やL-Aspでは生産しなかった。
我々はこの機構の解明に着手した。機構の解明には宿主-ベクター系の構築が必須である。現在までに栄養要求性の選択マーカーであるURA3遺伝子を用いた宿主-ベクター系を構築しているが、遺伝子の多重導入や多重破壊のためには他の選択マーカーが必要である。そこで私は薬剤耐性遺伝子を選択マーカーとした宿主-ベクター系を考えた。しかし、薬剤耐性遺伝子を発現させるためには、導入細胞由来のプロモーター配列を必要とする。そのプロモーターとしてよく用いられているのが、アクチン遺伝子のプロモーターである。アクチンは真核生物において最も多量に存在するタンパクであり、構成的に発現する。本研究ではアクチン遺伝子とそのプロモーター領域、ターミネーター領域のUJ1からの単離を検討した。酵母UJ1の染色体DNAを調製し、これを鋳型にして他の真核生物のアクチンタンパク質のアミノ酸配列から設計した縮重プライマーを用いて、UJアクチンの部分遺伝子断片を得た。アクチンの部分遺伝子断片をプローブにしたUJ1の染色体DNAのサザン解析を行った。結果、UJ1染色体DNA上のアクチン遺伝子のコピー数が1つであることがわかった。また、アクチン遺伝子とその周辺の制限酵素の位置関係が判明した。アクチン遺伝子をプローブにして、UJ1の染色体DNAライブラリによって形成されたプラークを検出し、アクチン遺伝子を有するファージクローンを9個単離した。ファージDNAのサザン解析によって、アクチン遺伝子の組込まれ方の異なる2種類のファージクローンが得られたことが明らかになったが、アクチン遺伝子全長とそのプロモーター領域とターミネーター領域を有するファージクローンを単離することはできなかった。しかし、得られた2種類のファージクローンをあわせるとアクチン遺伝子の全長とそのプロモーター領域とターミネーター領域が得られることが明らかとなった。